El 11 de abril de 1514 partía de Sanlúcar de Barrameda la expedición de 22 naves con más de 1000 personas y destino Santa María del Darién con Pedrarias Dávila a la cabeza, importante militar español recién nombrado gobernador de Castilla del Oro por el rey Fernando. Pedrarias llevaba órdenes de sustituir a Vasco Núñez de Balboa tras su “affaire” con Nicuesa y Enciso. Éste, conviene recordar, fue enviado prisionero por Balboa para ser ajusticiado en España, sin embargo consiguió el efecto contrario, al llegar a Sevilla fue liberado y tras contar las peripecias de Nicuesa y él mismo con Balboa el rey le creyó y decidió derrocar a Balboa sustituyéndole por una persona de plena confianza, y éste no era otro que Pedrarias, con quien Enciso retornaría a tierras americanas.
Le transmitió numerosas órdenes de lo que debía de hacer en el Darién una vez arribase: fundar nuevos asentamientos para controlar el territorio ocupado y utilizarlos como base para más expediciones de conquista, cristianizar e incorporar al régimen de trabajo europeo a los nativos y así cobrarles tributo y hacer la guerra a aquellos que no quisiesen colaborar. Este paquete de órdenes era muy similar al que entregó años antes a Nicolás de Ovando para que aplicase en el gobierno a la Española. El objetivo era bien claro, obtener los máximos beneficios lo antes posible.
Llegaron el 30 de junio de 1514. La decepción fue total, les habían contado que en la zona el oro se podía pescar y que la tierra era rica y generosa pero lo que se encontraron fue un poblado un par de kilómetros dentro de tierra en donde vivían 500 colonos con sus 1500 indios. Si bien estaban en plena fase de desarrollo aún no se le podía comparar con un pueblo español al uso.
Ocurrió como en la Isabela cuando llegó la primera gran flota comandada por Antonio de Torres con numerosa tropa y tripulación: la población no estaba preparada ni avisada de lo que se les venía encima en el tema de su alojamiento y alimento, por lo que los problemas comenzaron muy pronto.
Al mes de llegar gran parte de la expedición había caído enferma, incluido el gobernador Pedrarias, y muchos de ellos habían muerto. Enfermedades que eran más virulentas por la debilidad que el hambre y la mala alimentación provocaba en los cuerpos.
Para empeorar las cosas, los caciques de la zona, al principio aliados, al ver la cantidad de gente que arribó al Darién se dieron cuenta de que los extranjeros no estaban de paso sino que su intención era la de quedarse y explotar sus tierras por lo que cambiaron dramáticamente su posicionamiento y se opusieron a ellos.
A pesar de todo no cundió el desánimo y muy pronto se organizaron dos expediciones para fundar nuevos emplazamientos entre el Darién y el Mar del Sur descubierto por Balboa, una capitaneada por Juan de Ayora y compuesta por 400 hombres y otra dirigida por Bartolomé Hurtado que posteriormente se unió a la primera. Pero ambas iniciativas terminaron en fracaso, los hombres iban buscando principalmente oro y apenas lo encontraban salvo en manos de los indígenas, que fueron objeto de su ira y frustración culpándolos de engañarlos con el lugar en donde se supone que estaban las minas de oro. Se produjeron un sinfin de atrocidades que no fueron penadas por los gobernadores a pesar de las estrictas instrucciones reales en cuanto al trato a dispensar a los indígenas.
Pedrarias tenía que someter a juicio a Balboa por las denuncias de Enciso pero las noticias de sus descubrimientos aún no habían llegado a Castilla. Cuando éstas llegaron Pedrarias ya había salido de Cádiz por lo que no tuvo conocimiento del cambio de opinión del rey hasta el 20 de marzo de 1515, cuando esperando instrucciones para iniciar el juicio de residencia le llegó el nombramiento de Balboa como adelantado del Mar del Sur y gobernador y juzgado de Panamá y Coiba aunque subordinado a Pedrarias.