Tras aquellas primeras expediciones que entraron en el Río de la Plata de Juan Díaz Solís y de Alejo García  tuvo que pasar prácticamente una década para que se iniciaran nuevos intentos para buscar la ruta hacia el Mar del Sur.

Expedición de Fray García Jofre de Loaysa en 1525

En 1525 partió de La Coruña (España) una nueva expedición capitaneada por Fray García Jofre de Loaysa, presidente del Consejo de Indias y Obispo de Osma, con 7 buques y 450 hombres que tenían como destino las islas Molucas siguiendo la ruta encontrada por Magallanes unos años antes, pero no tuvieron éxito. Ante la falta de documentacion sobre esa expedición poco más puede decirse.

Expedición de Sebastián Caboto en 1526

Poquito después, la corona castellana encargó al marinero veneciano Sebastián Caboto (hijo de Juan Caboto) una expedición para seguir, al igual que Loaysa, la ruta realizada por Magallanes hacia las islas Molucas. Partieron el 5 de abril de 1526 de Cádiz (España) y al llegar a las costas brasileñas escucharon noticias de fabulosas riquezas en el Río de la Plata. Se encontraron con la tesitura de seguir adelante o dar crédito a esas historias de inmensas riquezas. Había habido casos en los que conquistadores habían desobedecido órdenes reales y gracias a eso obtenido grandes riquezas y victorias grandiosas, y con ellas el perdón real y la concesión de grandes privilegios. ¿Por qué no había de ocurrir lo mismo con ellos? Decidieron, pues, desobeceder la capitulación con el rey Carlos I.

Llegaron a la altura del Cabo de Santa María, punto de entrada del estuario del Río de Solís o Río de la Plata. Ascendieron pegados a la costa y se encontraron  a Francisco del Puerto, español superviviente de la matanza que sufrieron los hombres de Díaz de Solís, que les orientó y suministró valiosa información del área y de como llegar a la Sierra de la Plata.  Por el río Paraná navegaron hasta llegar a la confluencia con el río Carcarañá en donde Caboto fundó Sancti Spíritus el 11 de mayo de 1527, primer asentamiento español en las riberas del Plata. En este lugar permanecieron varios meses construyendo un bergantín más apropiado para la navegación fluvial.

A finales de diciembre, dejando una pequeña guarnición de 30 hombres en el fuerte, partieron en nueva expedición hacia el río Paraguay, el cual, según los nativos, les llevaría a su objetivo final. Pero al poco de partir comenzaron los problemas, las provisiones se agotaron y los lugares que recorrían no les ofrecían demasiados alimentos, además, algunas tribus nativas fueron amistosas pero otras no y al final tuvieron que regresar tras duros enfrentamientos con los indios agaces y quedarse prácticamente sin hombres.

Caboto decidió regresar a Sancti Spíritus y dar por cerrada esta expedición. Pero más tarde, y gracias a la llegada de la expedición de Diego García de Moguer, lograron refuerzos e intentaron ascender de nuevo el río Paraguay, pero volvieron a fracasar. Las relaciones con los indios se tensaron y finalmente éstos atacaron y destruyeron completamente Sancti Spiritus, dejando a los españoles sin un refugio seguro. Lo mejor era regresar a España. Caboto habría fracasado en su intento de conseguir riquezas en la Sierra de la Plata y así atenuar las consecuencias que su indisciplina podía causarle. Al llegar a Sevilla fue detenido y procesado pero las penas a las que fue condenado no pasaron de ser económicas y no demasiado altas por lo que ya en el año 1532 recuperó su cargo de capitán y piloto mayor.

Capitulación en favor de Don Pedro de Mendoza

El 21 de mayo de 1534 el rey Carlos I capituló en favor de don Pedro de Mendoza para la conquista del Río de la Plata.  En dicha capitulación se le daba permiso para conquistar entre los paralelos 25 y 36, es decir, todos los territorios del Río de la Plata y con la facultad de penetrar por ellos hasta hallar el Mar del Sur concediéndole doscientas leguas de la costa, contándose a partir de los territorios asignados en Chile a Diego de Almagro. La expedición la organizaría el adelantado a su costa y debía llevar mil hombres, en dos viajes, con mantenimientos para un año y cien caballos y lleguas.

Su misión era la de conquistar toda esa zona  que se pensaba era la puerta de entrada desde el Atlántico al Perú y, además,  había que evitar que los portugueses lo hiciesen antes; el embajador español en Lisboa, don Luis Sarmiento, había avisado de la preparación de una gran expedición portuguesa a la misma región,  debido a la indefinición de las fronteras entre el Brasil y los dominios españoles.

El 24 de agosto de 1535 salieron de Sanlúcar de Barrameda once naves y unos 1300 personas en dirección a las islas Canarias. En ella viajaban hidalgos, caballeros de órdenes, capitanes experimentados, parientes y allegados del Adelantado, regidores, contadores, escribanos, tesoreros, veedores, etc. Llegaron en los primeros días de enero de 1536 al estuario en donde poco después, en febrero, se fundó Santa María del Buen Aire, en su margen occidental. Esta iba a ser la base principal para explorar el camino que llevaría hasta la Sierra de la Plata.

Expedición de Juan de Ayolas al interior del Río de la Plata

Ya desde el principio y mientras se construía la nueva ciudad se enviaron expediciones hacia el interior, la primera fue la capitaneada por Juan de Ayolas, mayordomo de Don Pedro de Mendoza, que ascendió el río Paraná y el 15 de junio de 1536  fundó la ciudad de Corpus Christi cerca del río Coronda en un lugar de rico suelo, abundantes y variados cultivos y mucha pesca y caza e indígenas amistosos y colaboradores. En esta nueva ciudad dejó a cien hombres al mando del tesorero Gonzalo de Alvarado emprendiendo Ayolas el regreso a Buenos Aires con las naves bien abastecidas para reducir la situación de penuria que allí se vivía desde varios meses antes.

Primera destrucción de Buenos Aires

Al llegar se encontraron con el poblado prácticamente destruido y sus habitantes desnutridos tras sufrir un durísimo asedio de varias semanas por los nativos, y sobrevivieron gracias a que los mismos indios que realizaban la acción se quedaron sin alimentos y tuvieron que volver a sus tierras.

Nueva expedición de Ayolas al interior

A pesar del desastre de la ciudad, las buenas noticias que llevó Ayolas animaron a Pedro de Mendoza a enviarle de nuevo en busca de la Sierra de la Plata; rápidamente organizaron una nueva expedición que partió el 4 de octubre de 1536 del pequeño puerto de Buena Esperanza, pequeño fuerte que habían construido avanzado el río Paraná. La expedición estaba compuesta por una carabela y dos bergantines y se embarcaron 170 hombres. Mendoza regresó a Buenos Aires para seguir con los trabajos de reconstrucción y de aseguramiento del poblado. Allí llegaron por sorpresa desde la isla Catalina, situada al norte frente las costas de Brasil, varios españoles de expediciones anteriores que habían quedado en dicha isla y que habían formado familias con nativas. Mendoza les comentó los éxitos alcanzados y la nueva expedición que estaba realizando Ayolas; el capitán Hernando de Ribera, uno de los recién llegados, le adivirtió de que esa expedición, por los pocos miembros y lo peligroso de la zona, corría serio peligro. Ribera ya estuvo en el Río de la Plata con Caboto y sabía perfectamente que muchas tribus nativas no permitirían pasar por sus tierras a los extranjeros, por lo que se enfrentarían con ellos. Ante estas imprevistas noticias decidieron organizar una expedición de auxilio a Juan de Ayolas, con 3 bergantines, 100 hombres y al mando de los capitanes Juan de Salazar de Espinosa y Gonzalo de Mendoza. Dicha expedición tuvo mucha resonancia ya que fue la que posteriormente fundó la ciudad de la Asunción. Partieron el 15 de enero de 1537.

Ayolas nuevo gobernador del Río de la Plata

La salud del Adelantado don Pedro de Mendoza, se deterioró mucho durante esos días. Ya había llegado al Río de la Plata con bastantes problemas pero su energía y ambición le hicieron siempre continuar adelante, pero ya había llegado a un estado en el que los síntomas de su enfermedad impedían y estorbaban sus funciones de gobernador. Decidió volver a España, nombró a Juan de Ayolas como teniente de gobernador y, mientras la ausencia de este, cedía el mando a Francisco Ruiz Galán. Mendoza murió en el viaje de regreso a España sin haber conseguido llegar a su objetivo de la Sierra de la Plata ni asentado un poblamiento permanente ya que Buenos Aires sería abandonado a las pocas semanas de partir él, es más, aconsejó a los que allí se quedaron que se marchasen y buscasen otro emplazamiento río arriba.