Tras el azaroso viaje de vuelta de su cuarta expedición al Nuevo Mundo Colón llegó enfermo a Sevilla el 7 de noviembre de 1504. Bueno, realmente ya llevaba varios meses enfermo durante su estancia en Jamaica, pero aún así­ quiso volver a Castilla a resolver numerosos asuntos que afectaban a su patrimonio y sus derechos.

A los pocos dí­as de llegar recibió la triste noticia del fallecimiento de la reina Isabel, su principal valedora y protectora en sus proyectos. La reina falleció por un cáncer de útero en el Palacio Real de Medina del Campo (Valladolid) el 26 de noviembre de 1504. Sus últimos años fueron muy tristes y oscuros por las constantes desgracias familiares que sufrió: la muerte de su hijo Juan, de su hija Isabel y la de su nieto Miguel, la locura de Juana, los conflictos con su nuero Felipe y los problemas de su hija Catalina en Inglaterra. Estos hechos oscurecieron sus últimos años de reinado además de contemplar el fin de la casa Trastámara. Antes de morir realizó un codicilio a su testamento en el que mostraba su preocupación por el trato que recibí­an los nativos del Nuevo Mundo y ordenaba a todos sus súbditos que dieran un trato justo y humano a esas personas, a las que previamente ya habí­a tratado como súbditos suyos, es decir, con los mismos derechos e importancia que cualquier castellano.

Cristóbal Colón murió en Valladolid el 20 de mayo de 1506 aquejado de una fuerte poliartritis reumatoidea que le causaba fuertes dolores articulares. Entre su regreso a finales de 1504 y su muerte estuvo persiguiendo al rey Fernando y a la corte castellana tratando de asegurar sus privilegios y obtener el cumplimiento de las capitulaciones de Santa Fe. En Segovia, se entrevistó con el rey Fernando que con buenas palabras le despachó, también en Salamanca, Burgos y Valladolid, en donde ya no pudo más y le llegó la muerte.

Sus exequias fueron oficiadas en la iglesia de Nuestra Señora de la Antigua y sus restos inhumados en el monasterio de San Francisco.

El testamento fue redactado el 1 de abril de 1502 en Sevilla antes de partir en su última expedición al Nuevo Mundo y el 19 de mayo de 1506, un dí­a antes de su muerte, lo ratificó en Valladolid. En él nombra heredero principal a su hijo Diego, futuro gobernador de la Española sustituyendo a Nicolás de Ovando. También dona ciertas cantidades a su otro hijo, Hernando y a sus hermanos. En sí­ es una protesta contra los Reyes Católicos ya que dice que gran parte de lo que le correspondí­a por los acuerdos con ellos no se le habí­an liquidado. Dichos derechos le son entregados a sus hijos y también las deudas que tení­a contraí­das principalmente con mercaderes genoveses.

Este es el fin de uno de los personajes más importantes y controvertidos de la historia. Mucho se ha dicho que murió olvidado de todos y en la más absoluta pobreza, pero leyendo su testamento no da esa idea ya que a pesar de todos sus fracasos y errores poseí­a tí­tulos y magní­ficos derechos sobre sus descubrimientos en el Nuevo Mundo. Derechos por los que lucharí­an durante gran parte del siglo XVI sus ascendientes.